3)IDENTIFICATION

 

      L’extraction (cette méthode e été décrite précédemment) conduit généralement à un mélange d’un petit nombre d’espèces chimiques. Celles-ci peuvent être séparées et identifiée par une technique appelée chromatographie. La chromatographie permet de séparer les espèces chimiques présentes dans un mélange homogène. Nous introduirons, tout d’abord, la technique chromatographique par une approche historique.

      De plus, il existe énormément de méthodes chromatographiques, comme la chromatographie sur couche mince ( CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie ionique, la chromatographie sur colonne, la chromatographie supercritique. Les dernières cités ne sont que des exemples, il en existe beaucoup d’autres mais nous n’allons développer que les chromatographies sur couche mince et sur colonne, car ce sont les méthodes les plus utilisées à notre niveau.

      Ensuite nous parlerons aussi de la chromatographie en phase gazeuse qui nous a été présentée lors de notre visite à l’usine Aromatech, et du spectromètre de masse qui est utilisé afin de connaître les différents constituants d’un arôme. Nous finirons par décrire la chromatographie que nous avons réalisée.

 

a) APPROCHE HISTORIQUE

 

      La première chromatographie a été réalisée en 1906 par le botaniste Mikhaïl Tswett et consistait à séparer les pigments d’une feuille d’épinard. Tswett avait observer la séparation des colorants végétaux, ont les chlorophylles, lorsqu’il filtrait leur solution dans l’éther de pétrole, sur une colonne de carbonate de calcium.

      Dans ces conditions, en effet, des zones colorées vertes et jaunes se forment. Tswett constatait : »Tout comme les rayons lumineux d’un spectre, les différentes composantes d’un mélange de colorants se déploient sur la colonne de carbonate de calcium selon une loi et peuvent être analysées qualitativement et quantitativement.

 

b) CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

 

 

 

      Cette méthode très facile à mettre en œuvre est une des principales utilisées dans les laboratoires. Elle présente l’avantage de ne nécessiter que peu de matériel et de donner des résultat facilement interprétables mais pas toujours très reproductibles.

       La chromatographie sur couche mince (CCM)  repose principalement sur des phénomènes d’adsorption* : la phase mobile est un solvant* ou un mélange de solvants*, qui progressent le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.

       Apres que l’échantillon a été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant*.

       Les principaux éléments d’une séparation chromatographie sur couche mince sont :

 

-          la cuvechromatographique :un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.

-          La phase stationnaire : une couche d’environ 0,25mm de gel de silice ou d’un autreadsorbant est fixée sur une plaque de verre.

-          L'échantillon : environ un microlitre de solution diluée ( 2 à 5 %) u mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessusde la surface de l’éluant.

-          L'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l'échantillon. 

 

·                  Révélation

 

      Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon.      

    Les méthodes usuelles de révélation sont les suivantes : radiation UV, fluorescence, révélateurs chimiques. En exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés apparaissent sous forme de taches brillantes. Si un indicateur fluorescent est incorporé à l’absorbant, la plaque entière devient fluorescente lorsqu’elle est soumise une radiation UV ; les composés y sont révélé sous forme de taches sombres

CCM d'une encre noire (une encre noire est un mélange d'encres de plusieurs couleurs) (21*)

c) CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE (CC)

      C’est une technique basée sur des phénomènes d’adsorption*. La phase solide, le plus souvent d’alumine ou la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables ; l’échantillon, en solution concentrée, est déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de l’écoulement continu d’un éluant, traversant la colonne par gravité ou sous l’effet d’un faible pression.

      Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans l’éluant. Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones cylindriques qui se séparent en migrant vers el bas.

       La séparation dépend de l’éluant, de l’adsorbant, de la dimension de la colonne et de la vitesse d’élution.

 

Chromatographie sur colonne d’un extrait d’épinard (*22)

 

    L'éluant a été préparé à partir d'isopropanol et d'éther de pétrole. Celui-ci permet de mobiliser les pigments présents dans l'extrait d'épinard et de les faire migrer au travers d'une colonne de sucre en poudre. On voit bien quatre bandes de couleur qui correspondent aux pigments suivants: carotènes, chlorophylle a, lutéine, chlorophylle.

 

 

b) LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

 

 

 

 

 

 

     Lors de notre visite de l’usine AROMATECH, Nathalie Chevrier, chimiste, nous a expliqué le fonctionnement de la chromatographie en phase gazeuse et du spectromètre de masse. Par l’intermédiaire de colonnes chromatographiques, des molécules aromatiques sont analysées; les produits sont injectées dans une colonne contenue dans un four, dont la température croit au court de l’analyse jusqu'à atteindre 230° C.

     Les molécules sont séparées tout au long de leur cheminement dans la colonne. Elles sont ensuite brûlées et matérialisées sous forme de pics par l’intermédiaire d’un logiciel informatique. Les différents pics nous indiquent la quantité de produit, plus  le pic est grand, plus il y a de produit.

     Madame Chevrier nous a donné un exemple de révélation de l’arôme banane réalisé en chromatographie en phase gazeuse. Vous le trouverez en annexe 11. Les numéros situés au dessus de spics correspondent au temps que les différents constituants ont mis pour sortir de la colonne et être brûlés.

      Ensuite, la nature chimique de ces pics est déterminée par un spectromètre de masse : c’est un appareil qui permet de déterminer la formule chimique des différents constituants. Un exemple de révélation par spectromètre se trouve en annexe 12.

 

 

       

 

Schéma de principe d'un appareil chromatographie en phase gazeuse(23*) 

 

 

                        

Spectromètre de masse (*24)

 

 

 

 

e) UN EXEMPLE DE CHROMATOGRAPHIE

 

Nous réalisons une chromatographie sur couche mince pour identifier l’acétate d’isoamyle que nous avons préparé.

 

·                  MATERIEL

 

- alcool isomylique

- échantillon contenant : acétate d’isoamyle + alcool isoamylique

- acétate d’isomyle synthétisé

- éluant : cyclohexane

- permanganate de potassium

- plaque de gel de silice sur polyester (ou aluminium)

- pics en bois

- gants

- sèche cheveux

 

 

·                  DEROULEMENT DE NOTRE EXPERIENCE

 

-          Nous traçons le front de l’éluant sur la plaque de gel

-          Nous déposons ensuite, à l’aide d’un pic, trois taches différentes des trois produits.

- Nous mettons trois gouttes successives pour chaque produit en séchant entre chaque goutte.

- Nous introduisons ensuite la plaque dans une cuve à chromatographie contenant l’éluant : le cyclohexane.

-          Nous attendons environ vingt minutes que les migrations s‘effectuent.

-          Nous sortons la plaque ettraçons le front de l’éluant.

-          Nous révélons ensuite notre chromatographie grâce à du permanganate de potassium.

-              Nous essayons aussi avec les U.V

-          Nous voyons alors que les deux taches de l’échantillon correspondent,une avec l’alcool isoamylique et l’autre avec notre synthèse d’alcool isoamyle. Nous entourons les taches au crayon gris.

 

    Les méthodes d’extraction d’arômes naturels sont nombreuses mais souvent longues et onéreuse, ce qui explique le recourt à la synthèse d’arôme. Lorsque la synthèse de l’arôme est terminée, des laboratoires d’application se chargent d’introduire des arômes dans les aliments pour vérifier que l’arôme est conforme aux espérances.

 

    Après une synthèse, l’identification est obligatoire. Cependant, elle ne permet pas d’indiquer la qualité aromatique des extraits obtenus. Seule l’expérience des aromaticiens permettra d’affiner le produit obtenu.

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